郁闷事情

入得谷来,祸福自求。
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tiffany
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郁闷事情

Post by tiffany » 2008-05-21 14:31

最近还是在做挡车女工的活儿,具体形容就是用抗体拉一种蛋白,看看别的蛋白会否跟这个蛋白一起被拉下来。自然要看的话就得西点,---我们以前说过,就是让蛋白质跑胶,跑完胶再转移到膜上,再用抗体标记沾在膜上的蛋白,再用显影液染这个抗体,最后的结果就是膜上一条一条的蛋白质小横线。
漂亮的西点结果就是平平的一条深浅均匀的直线,老子跑出来被扯下来的蛋白质那一条上倒是有我们觉得应该有的蛋白----非常好的事情,可是这个蛋白条带那条小横线老是不好看,具体问题有一头儿特别深成了老大一个黑点儿,要是西点出来带深浅匀乎了就有它不直而倾斜的问题,而最诡异的是它邻居带就是直的。我老苦恼之余自然请教专家兄弟,该兄弟的西点图片干净漂亮得很,我跟他描述必我的问题,伊尴尬笑道从来没见过跑成那样的胶,不知道为什么会那样。我老很郁闷,出问题还出个专家都没有见过的,我老这个非专家解决问题起来不得痛苦死。

the end
有酒有酒 闲饮东窗

silkworm
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Post by silkworm » 2008-05-21 14:36

我问你,这个条是在胶的中间还是两边,靠边的位子常常会跑歪。

tiffany
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Post by tiffany » 2008-05-21 14:40

中间。我泪奔的回。
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火星狗
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Post by 火星狗 » 2008-05-21 14:44

Container 不平衡或者不均匀?要是能换部件,换块看看?

silkworm
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Post by silkworm » 2008-05-21 14:48

看,technique-oriented和equipment-oriented的人,分歧在哪里。

“有一头儿特别深成了老大一个黑点儿”---这个让我想到,跑的是变性的胶么?如果是的话,上胶前用的loading buffer,denaturing/reducing agent是什么?有时变性的不够,会让条带不锋利,但“一头儿特别深”比较少见。

再,你用pre-poured胶还是自己倒?听说过用现成胶有时会有悲剧。

tiffany
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Post by tiffany » 2008-05-21 14:52

我就是用的现成胶啊,事实上,我们这连自己做胶的东西都不齐了。
那么再追问一个技术细节问题,如果是sb变性力度不够的话,那么最后一步elude beads可以用5x sb么?我现在用的是biorad产laemmli buffer :roll:
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森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-21 15:18

白博这是co-IP啊:mrgreen:
如果你用现成的胶,从包装里拆出来最好先冲一冲再装装置。 他们那pre-cast的胶为了要保存得久不知道用了什么药,据我们的博后说如果不冲一下直接就装有时候会有奇怪的带型。
如果你已经做过一两次,心里有底这是个能做出来的实验,不妨少用一点儿input。有时候蛋白多了挤作一团,自然带型就不好看了。那些蛋白量少的带型都横平竖直漂亮的很,蛋白多的就奇形怪状什么都有。
我做co-IP最后一步都不elute,直接拿loading buffer加了beta-mercaptoethanol煮,以提高浓度。我的loading buffer就是照着molecular cloning配的。elute的效率不好,除非你还想要用这个蛋白做点什么别的实验。SB是什么?
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Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-21 17:43

这个贴应该标记[非生物女慎入],你们一个一个接得那么紧凑,还互相很明白的样子,简直是外国话世界。
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。

lucoco
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Post by lucoco » 2008-05-21 18:02

不清楚情况的人猜:
1。 蛋白浓度过高,不知道你洗柱的时候看过OD没有,特别浓的有这个问题。
2。buffer没有平衡好, 过酸过碱过重。这个我一般洗柱后会用PBS交换一下,不过这一步作太复杂,我想如果你OD 够的话可以考虑用PBS dilute.
3。 有aggregate,加sample buffer 后煮了可以在离心一下,取上清加样?
3. 2抗(显色)抗体浓度过高,可以稀释下。
一个人的性格决定他的命运。

tiffany
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Post by tiffany » 2008-05-21 19:14

我不是过蛋白柱的,就是beads拿sample buffer煮煮,甩干,取上清就上样了。
小火焰你们是拿什么洗胶?咋洗?
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笑嘻嘻
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Post by 笑嘻嘻 » 2008-05-21 19:23

Elysees wrote:这个贴应该标记[非生物女慎入],你们一个一个接得那么紧凑,还互相很明白的样子,简直是外国话世界。
我都懒得说她们了都。就进来看看有哪个帖子是浅显易懂的。
云浆未饮结成冰

森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-21 20:38

我一般头一次谨慎地用PBS洗,如果有结果,但是脏,就用 PBST,加0.01%Tween-20;如果一下子又没了,就改成PBST 0.005%tween-20。总之要想洗得干净就加detergent多些,如果想结果sensitive就不加或者少加detergent。
能过柱的得要大量蛋白才行,我做co-IP的那一点点还不够喂柱子的,所以也就是10几或者几十ul的珠子,拉下来,洗干净,加sample buffer,煮。Sample buffer里那些SDS和beta-merca,95度煮 10分钟,应该尽够变性了。太浓的sample buffer跑出来会歪,尤其是一条道浓旁边的都不够浓的时候。我见有人把空道也用sample buffer平衡上,就是防止它跑歪。
不过WB的胶不好看的常有,别太求全 :mrgreen:
你看看,我就知道会被人鄙视的!
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Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-21 20:43

啊啊啊,我惊喜地发现一个我认识的字儿,火焰你有tween-20?tween-80有不?给我寄点儿来,咩哈哈哈~~~ :music004: :music004:
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。

森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-21 20:45

Tween-80我没有。。。Tween-20我们的经理买错了,买了个五升装。尽形寿,我是看不到它有用完的一天了 :verysad:
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Knowing
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Post by Knowing » 2008-05-21 20:50

那是什么?你们的黑话!
Nevertheless, she persisted.

森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-21 21:16

哎我突然才发现白博问的是洗胶不是洗珠子。。。我就是在水笼头底下冲冲,冲个一两秒就行了。冲完了才拔梳子。如果你实在不放心,用transfer buffer淋一淋也行。不过我用水龙头冲从来没出过问题。我们的是Bio-Rad的。以前用Invitrogen的,倒是没有听说过要冲。但那时候的胶也常有不好看的带型出现,我们都接受现状了。
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Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-21 22:15

Knowing wrote:那是什么?你们的黑话!
Tween-xx吗?那个是经金粟介绍可以用来跟橄榄油10:1配合(橄榄油10)做自制卸妆油的(好像是牛尔的方子)东西,好像是叫表面活化剂?敏感皮肤用80,油性皮肤用20,我用了快两周,真的很不错,黑头都少了很多,一定程度的改善了三角区的毛孔问题。 :love011: :love011: :love011:
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。

simonsun
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Post by simonsun » 2008-05-21 23:15

Elysees wrote:Tween-xx吗?那个是经金粟介绍可以用来跟橄榄油10:1配合(橄榄油10)做自制卸妆油的(好像是牛尔的方子)东西,好像是叫表面活化剂?敏感皮肤用80,油性皮肤用20,我用了快两周,真的很不错,黑头都少了很多,一定程度的改善了三角区的毛孔问题。 :love011: :love011: :love011:
这么好的东西,请问哪里有得买呢? :artist:
Violent delights.

orangetabby
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Post by orangetabby » 2008-05-22 6:17

Elysees wrote:
Knowing wrote:那是什么?你们的黑话!
Tween-xx吗?那个是经金粟介绍可以用来跟橄榄油10:1配合(橄榄油10)做自制卸妆油的(好像是牛尔的方子)东西,好像是叫表面活化剂?敏感皮肤用80,油性皮肤用20,我用了快两周,真的很不错,黑头都少了很多,一定程度的改善了三角区的毛孔问题。 :love011: :love011: :love011:
真的吗?

我们有Tween20,Tween80不知道能找到不?

那个是大分子量(m.w.)的东西,粘得很.怎么能保证是准确的10:1? 在家里又没有准确的量具,我在实验室用都是靠多配来保证误差不至于太大.
性格决定命运, 基因决定性格. 所以请放心大胆的怨天怨地怨爹娘.

森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-22 8:00

在家不知道,在实验室我是把枪头剪成阔口,尽量少把枪头插到液面以下。
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silkworm
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Post by silkworm » 2008-05-22 12:25

Tween 20 粘度还好啦,跟甘油啊、triton-X什么的都差不离儿,关键是起泡儿---废话哈,表面活性剂能不起泡儿么。

小E,可以从网上买的,我看了看Sigma Aldrich的catalog。
Tween 20
25ml (毫升) $16.10
500ml $30.30

Tween 80
只有18升的大包装,273.50

Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-22 13:05

那个是大分子量(m.w.)的东西,粘得很.怎么能保证是准确的10:1? 在家里又没有准确的量具,我在实验室用都是靠多配来保证误差不至于太大.
我估摸说,这又不是做分析实验,不用那么精确了。我就是大概的。譬如说有一个5毫升的瓶子,一个50毫升的瓶子。然后用50毫升装满处女橄榄油,5毫升装满tween-80,然后混在一个瓶子里面,用之前用力晃匀――我晃个50下左右(这个很重要,金粟强调说),要干着手和脸(这个也很重要,金粟也强调,不然他们遇水就乳化了)在脸上揉,揉个十分钟左右,刚开始我都能在手上看到揉出来的黑头.......这几天比较少了,然后温水冲掉就可以――我就是一边淋浴一边冲的,感觉很干净。
孙西门的皮肤如果不算特别敏感,还可以之后间歇性的用绿泥。
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。

Knowing
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Post by Knowing » 2008-05-22 13:32

对白头管用么?
其实最好的清洁是出汗。我做热愈加的那几个月皮肤极其干净,鼻子上的毛孔都缩的看不见了。现在又回来了。。
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charis
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Post by charis » 2008-05-22 13:39

"热愈加", 怎么个热法?好奇。

笑嘻嘻
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Post by 笑嘻嘻 » 2008-05-22 13:39

不化妆的话用这个也好嘛?
云浆未饮结成冰

Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-22 13:41

白头不知道,我好像不太长这个,至少最近没有,所以试验不出来。
如果靠热瑜伽也行,那么泡澡什么的也应该有效才对......可我老泡澡会觉得皮肤很干,也不行啊。

咱们终于成功把这个帖子拧过来了~~ :admir001: :admir001:
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Knowing
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Post by Knowing » 2008-05-22 13:41

就是在加热的房间里做。暴出汗暴喝水。做完特愉快,浑身都是干净松弛的。做的时候比较痛苦。我做了六七个月抗不住,还是改只做普通愈加了。
Nevertheless, she persisted.

Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-22 13:42

不化妆的话用这个也好嘛?
我就不化妆啊,不出门上班就不修边幅,哎,我早上有时候连脸都不洗。。。这个方子好像就是去脸上油污的,洗干净之后一定要用toner+cream。
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森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-22 13:51

白博不出声,我估计她要明天才上来汇报结果,如果她已经在这儿汇总了小窍门儿回实验室再战江湖的话。我从来不太勤奋, 西点都要分两天做。现在有了阿土仔,新妈妈估计也得分两天做了。
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silkworm
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Post by silkworm » 2008-05-22 13:52

小火焰你上次说的西点问题解决得怎样了?

Elysees
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Post by Elysees » 2008-05-22 13:57

哼,哼,你们别想拧回去。

蚕啊,我去你说的网站上查了查,发现出来一堆Tween-80:viscous liquid,viscous liquid, Preservative Free, Low-peroxide; Low-carbonyls, average Mn ~1,310......,这都是什么跟什么啊?该用哪个啊?
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/se ... IAL;274364
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森林的火焰
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Post by 森林的火焰 » 2008-05-22 14:38

这一大串里,有纯度不同的,有检测过可以用于细胞培养的,有用于分子生物学实验的。小E你要买的话,保险起见,可以买用于tissue culture的。脸不是活tissue么 8)
蚕你说的是那个检测TAF1?我小人家有意把这个实验“忘掉“一阵子了。等手头的老鼠辨认和细胞分化做得告一段落再说。我不喜欢同时做干净实验和脏实验,当然主要是因为懒
:oops:
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niuniu
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Post by niuniu » 2008-05-22 18:34

生化盲好奇地问,在小E(呃,金粟?牛尔?)的配方里,这个tweenXX除了起泡还有什么作用?它会和橄榄油反应吗?

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