郁闷事情
郁闷事情
最近还是在做挡车女工的活儿,具体形容就是用抗体拉一种蛋白,看看别的蛋白会否跟这个蛋白一起被拉下来。自然要看的话就得西点,---我们以前说过,就是让蛋白质跑胶,跑完胶再转移到膜上,再用抗体标记沾在膜上的蛋白,再用显影液染这个抗体,最后的结果就是膜上一条一条的蛋白质小横线。
漂亮的西点结果就是平平的一条深浅均匀的直线,老子跑出来被扯下来的蛋白质那一条上倒是有我们觉得应该有的蛋白----非常好的事情,可是这个蛋白条带那条小横线老是不好看,具体问题有一头儿特别深成了老大一个黑点儿,要是西点出来带深浅匀乎了就有它不直而倾斜的问题,而最诡异的是它邻居带就是直的。我老苦恼之余自然请教专家兄弟,该兄弟的西点图片干净漂亮得很,我跟他描述必我的问题,伊尴尬笑道从来没见过跑成那样的胶,不知道为什么会那样。我老很郁闷,出问题还出个专家都没有见过的,我老这个非专家解决问题起来不得痛苦死。
the end
漂亮的西点结果就是平平的一条深浅均匀的直线,老子跑出来被扯下来的蛋白质那一条上倒是有我们觉得应该有的蛋白----非常好的事情,可是这个蛋白条带那条小横线老是不好看,具体问题有一头儿特别深成了老大一个黑点儿,要是西点出来带深浅匀乎了就有它不直而倾斜的问题,而最诡异的是它邻居带就是直的。我老苦恼之余自然请教专家兄弟,该兄弟的西点图片干净漂亮得很,我跟他描述必我的问题,伊尴尬笑道从来没见过跑成那样的胶,不知道为什么会那样。我老很郁闷,出问题还出个专家都没有见过的,我老这个非专家解决问题起来不得痛苦死。
the end
乡音无改鬓毛衰
白博这是co-IP啊:mrgreen:
如果你用现成的胶,从包装里拆出来最好先冲一冲再装装置。 他们那pre-cast的胶为了要保存得久不知道用了什么药,据我们的博后说如果不冲一下直接就装有时候会有奇怪的带型。
如果你已经做过一两次,心里有底这是个能做出来的实验,不妨少用一点儿input。有时候蛋白多了挤作一团,自然带型就不好看了。那些蛋白量少的带型都横平竖直漂亮的很,蛋白多的就奇形怪状什么都有。
我做co-IP最后一步都不elute,直接拿loading buffer加了beta-mercaptoethanol煮,以提高浓度。我的loading buffer就是照着molecular cloning配的。elute的效率不好,除非你还想要用这个蛋白做点什么别的实验。SB是什么?
如果你用现成的胶,从包装里拆出来最好先冲一冲再装装置。 他们那pre-cast的胶为了要保存得久不知道用了什么药,据我们的博后说如果不冲一下直接就装有时候会有奇怪的带型。
如果你已经做过一两次,心里有底这是个能做出来的实验,不妨少用一点儿input。有时候蛋白多了挤作一团,自然带型就不好看了。那些蛋白量少的带型都横平竖直漂亮的很,蛋白多的就奇形怪状什么都有。
我做co-IP最后一步都不elute,直接拿loading buffer加了beta-mercaptoethanol煮,以提高浓度。我的loading buffer就是照着molecular cloning配的。elute的效率不好,除非你还想要用这个蛋白做点什么别的实验。SB是什么?
http://harps.yculblog.com
搬家了搬家了
搬家了搬家了
我一般头一次谨慎地用PBS洗,如果有结果,但是脏,就用 PBST,加0.01%Tween-20;如果一下子又没了,就改成PBST 0.005%tween-20。总之要想洗得干净就加detergent多些,如果想结果sensitive就不加或者少加detergent。
能过柱的得要大量蛋白才行,我做co-IP的那一点点还不够喂柱子的,所以也就是10几或者几十ul的珠子,拉下来,洗干净,加sample buffer,煮。Sample buffer里那些SDS和beta-merca,95度煮 10分钟,应该尽够变性了。太浓的sample buffer跑出来会歪,尤其是一条道浓旁边的都不够浓的时候。我见有人把空道也用sample buffer平衡上,就是防止它跑歪。
不过WB的胶不好看的常有,别太求全
你看看,我就知道会被人鄙视的!
能过柱的得要大量蛋白才行,我做co-IP的那一点点还不够喂柱子的,所以也就是10几或者几十ul的珠子,拉下来,洗干净,加sample buffer,煮。Sample buffer里那些SDS和beta-merca,95度煮 10分钟,应该尽够变性了。太浓的sample buffer跑出来会歪,尤其是一条道浓旁边的都不够浓的时候。我见有人把空道也用sample buffer平衡上,就是防止它跑歪。
不过WB的胶不好看的常有,别太求全
你看看,我就知道会被人鄙视的!
http://harps.yculblog.com
搬家了搬家了
搬家了搬家了
哎我突然才发现白博问的是洗胶不是洗珠子。。。我就是在水笼头底下冲冲,冲个一两秒就行了。冲完了才拔梳子。如果你实在不放心,用transfer buffer淋一淋也行。不过我用水龙头冲从来没出过问题。我们的是Bio-Rad的。以前用Invitrogen的,倒是没有听说过要冲。但那时候的胶也常有不好看的带型出现,我们都接受现状了。
http://harps.yculblog.com
搬家了搬家了
搬家了搬家了
-
- Posts: 310
- Joined: 2003-12-06 12:59
我估摸说,这又不是做分析实验,不用那么精确了。我就是大概的。譬如说有一个5毫升的瓶子,一个50毫升的瓶子。然后用50毫升装满处女橄榄油,5毫升装满tween-80,然后混在一个瓶子里面,用之前用力晃匀――我晃个50下左右(这个很重要,金粟强调说),要干着手和脸(这个也很重要,金粟也强调,不然他们遇水就乳化了)在脸上揉,揉个十分钟左右,刚开始我都能在手上看到揉出来的黑头.......这几天比较少了,然后温水冲掉就可以――我就是一边淋浴一边冲的,感觉很干净。那个是大分子量(m.w.)的东西,粘得很.怎么能保证是准确的10:1? 在家里又没有准确的量具,我在实验室用都是靠多配来保证误差不至于太大.
孙西门的皮肤如果不算特别敏感,还可以之后间歇性的用绿泥。
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。
白博不出声,我估计她要明天才上来汇报结果,如果她已经在这儿汇总了小窍门儿回实验室再战江湖的话。我从来不太勤奋, 西点都要分两天做。现在有了阿土仔,新妈妈估计也得分两天做了。
http://harps.yculblog.com
搬家了搬家了
搬家了搬家了
哼,哼,你们别想拧回去。
蚕啊,我去你说的网站上查了查,发现出来一堆Tween-80:viscous liquid,viscous liquid, Preservative Free, Low-peroxide; Low-carbonyls, average Mn ~1,310......,这都是什么跟什么啊?该用哪个啊?
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/se ... IAL;274364
蚕啊,我去你说的网站上查了查,发现出来一堆Tween-80:viscous liquid,viscous liquid, Preservative Free, Low-peroxide; Low-carbonyls, average Mn ~1,310......,这都是什么跟什么啊?该用哪个啊?
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/se ... IAL;274364
我自横刀向天笑,笑完我就去睡觉。
这一大串里,有纯度不同的,有检测过可以用于细胞培养的,有用于分子生物学实验的。小E你要买的话,保险起见,可以买用于tissue culture的。脸不是活tissue么
蚕你说的是那个检测TAF1?我小人家有意把这个实验“忘掉“一阵子了。等手头的老鼠辨认和细胞分化做得告一段落再说。我不喜欢同时做干净实验和脏实验,当然主要是因为懒
蚕你说的是那个检测TAF1?我小人家有意把这个实验“忘掉“一阵子了。等手头的老鼠辨认和细胞分化做得告一段落再说。我不喜欢同时做干净实验和脏实验,当然主要是因为懒
http://harps.yculblog.com
搬家了搬家了
搬家了搬家了